تحييد البلازميدات
Plasmids Curing
إن فقدان البلازميدات التي تتحكم بعدد من الصفات المظهرية مثل المقاومة للمضادات الحيوية والمعادن الثقيلة وغيرها من صفات الخلايا الجرثومية إما أن يكون تلقائياً Spontaneous أو مستحثاً Induced.
وتضاعف البلازميد غير معتمد على تضاعف الكروموسوم الاساس Main Chromosome للجراثيم، وفي بعض الحالات تفشل نسخه من البلازميد في الانتقال من الخلية الام إلى إحدى الخليتين البنويتين Daughter Cell.
إن معاملة الخلايا المحتوية على البلازميد بالاكردين Acridine أو بتعريضها لأشعة X أو التجويع للثايميدين Thymidine Starvation سوف تؤدي إلى توقف التضاعف التكراري للبلازميد دون التأثير على تضاعف الكروموسوم الأصلي.
وإحدى السمات المهمة لبلازميدات الجراثيم أنه يمكنها أن تزال من الجينيوم الجرثومي وأكثر المواد الفعاله هي الاكردينات
والتي تتضمن الـ Proflavine وAcriflavine و Acridine Orange و Euflavine (Stanisich and Holloway,1969) وهذه الأكردينات مستخدمة بشكل واسع لازالة مختلف العناصر الوراثية خارج الكروموسوم Extrachromosomal Elements مثل عوامل الخصوبة Sex Factors وعوامل المقاومة R-factors من الخلايا الجرثومية Molnar et al., 1978)، حيث يثبط تضاعف عامل F في الحالة المستقلة في جرثومة E. coli في حين لا تستطيع هذه المواد ازالة عامل F في الحالة المندمجة الكروموسوم في سلالات Hfr) High frequency of recombination) عند المعاملة باصباغ الاكردين فان 100% من خلايا F+ تحيد من الـ F فتصبح F- في حين لا يوجد تحييد للعامل F في سلالات Hfr (Grindley et al., 1970 ;Clowes et al., 1965) إذ أن آلية عمل الاكردينات هو تثبيط تضاعف البلازميد في حين يستمر كروموسوم الخلية الجرثومية بالتضاعف وترتبط الاكردينات ايضاً بالحوامض النووية للجرثومة(Lauer et al ., 1981) وتستطيع إحداث طفرات ازاحة Frameshift Mutations عن طريق دخولها بين زوج من النيوكلوتيدات Nucleotides الذي قد يكون في منشأ التضاعف مما يؤدي الى عرقلة في عزل الـ DNA البلازميدي (Moutschen and Ehrenberg,1985).
ويعمل الاكردين البرتقالي على تحييد F/ lac من جرثومة K-12 E. coli ومن المحتمل انه يقتحم الـDNA ويظهر تأثيراً خاصاً على تضاعف عامل F (Salisbury et al.,1972).
وعند معاملة سلالة Staphylococcus aureus U9W بالبروفلافين او الاكردين البرتقالي فان الخلايا المقاومة تتحول الى خلايا حساسة، على الرغم من ان فقدان المقاومة مع الاكردين البرتقالي بتكرار واطئ الى حد ما فان البروفلافين اقل فعالية في تحويل الخلايا المقاومة الى خلايا حساسة.
فبعد معاملة الخلايا الجرثومية المذكورة سابقاً المقاومة للبنسلين بالاكردين البرتقالي وجد ان اكثر من 6% من الخلايا المقاومة للبنسلين اصبحت حساسة للبنسلين.
وقد بيّنت كل النتائج ان الاكردين البرتقالي اكثر فعالية من البروفلافين في إزالة مقاومة البنسلين والمعدلات العالية لازالة المقاومة وتم الحصول عليها عندما يكون الاس الهيدروجيني للوسط الغذائي 7.6 وهي ظروف ضرورية للازالة المثلى لعاملF.
وقد ذكر Rasool وآخرون أن الاكردين البرتقالي يستخدم بوصفه مادة محيدة لازالة البلازميدات المقاومة للمضادات الحيوية في عزلات Klebsiella spp.، حيث اظهرت العزلات الجرثومية المدروسة اختلافاً في نسب ازالة المقاومة لبعض المضادات الحيوية المدروسة والمحمولة على R- plasmid فضلاً عن فعالية هذا المحيد لازالة عامل الخصوبة F- plasmid والمسؤول عن عملية الاقتران الجرثومي.
كذلك يعمل الاكري فلافين على تثبيط انتقال عامل R بسبب تثبيط خاص لتصنيع الـ DNA الضروري لنقل الـEpisome (Arai and Watanabe, 1967). لاحظ Grindley وآخرون (1970) انه عند معاملة سلالة K12 F+ (K) لجرثومة E. coli K-12 بالاكري فلافين بتركيز 10 مايكروغرام/مل فان 96% من المستعمرات فقدت K، لكن مستعمرتان من المستعمرات العشر المختبرة فقدت عامل الخصوبة F أيضاً وأمكن الحصول على عزلات جرثومية ذات أنماط هي: F+K- و F-K+ و F-K-. فضلاً عن ذلك أن إزالة مقاومة المضادات الحيوية لمجموعة Macrolide (Leucomycin و Oleandomycin و Erythromycin) في سلالات جرثومة S. aureus وذلك عن طريق معاملة السلالات المقاومة بالاكري فلافين (Hashimoto et al., 1964).
بروميد الاثيديوم Ethidium Bromide مادة قوية وأكثر فعالية لتحييد بلازميدات الـ Penicillinase لسلالات S. aureus المقاومة للزئبق وليس من السلالات الحساسة لأيونات الزئبق (Warren et al., 1974 ; Rubin and Rosenblum, 1971) ويرتبط بروميد الاثيديوم مع الـ (DNA) Deoxyribonucleic Acid والـ (RNA) Ribonucleic Acid ويثبط الـ DNA Polymerase والـ RNA Polymerase (Bouanchaud et al., 1969).
ويمكن استخدام المضادات الحيوية بوصفها مواد محيدة ومن امثلتها المضاد الحيوي الريفامبين Rifampin وهو مركب نصف اصطناعي Semisynthetic Compound يثبط نمو الجراثيم الموجبة لصبغة كرام فضلاً عن عدد من الاحياء المجهرية السالبة لصبغة كرام مثل E. coli و Pseudomonas و Klebsiella. ويعد الريفامبين فعالاً جداً ضد ، S. aureus و Haemophilus influenzae و Neisseria meningitidis، وهو قاتل للجراثيم داخل الخلية وخارجها (Behera, 1995 ; Gilman et al., 1985 ) ويثبط الريفامبين نمو الجرثومة عن طريق ارتباطه القوي مع الـ RNA Polymerase فيها لذلك فهو مثبط لتصنيع الـ RNA الجرثومي (Brooks et al., 2001)، حيث يرتبط مع الـ -subunit للـ RNA Polymerase وعلى وجه الخصوص يثبط تصنيع RNA وبذلك يعوق نمو الجرثومة (Gado et al., 1982 ; Linn et al., 1975 ) وللريفامبين تأثير شاف على بعض عناصر DNA الـ Staphylococcal الخارج كروموسومية.
هناك فرضيتان لتفسير آلية عمل الريفامبين:
1- أن الريفامبين يثبط تضاعف DNA الابيسوم مقارنة بـ DNA الكروموسومي.
ويمكن أن يكون التحييد نتيجة لأختزال مستوى تصنيع بعض الجزيئات البروتينية الخاصة والضرورية لتضاعف الابيسوم. أن هذه الفرضية تلقت بعض الدعم من خلال الملاحظات التي تضمنت أن الريفامبين يثبط تعبير بعض جينات F أختيارياً.
2- تتضمن الفرضية الثانية أن جزيئة RNA المعينة ضرورية لتضاعف عامل الجنس Sex Factor واستنساخ هذه الجزيئة يكون حساساً للريفامبين. حيث يمكن أن تصنع إمّا على الكروموسوم أو على الابيسوم.
يمكن تحييد البلازميدات باستخدام Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) فهي مادة قوية للتحييد وتأثيرها في جرثومة E. coli يكون اكثر سمية لخلايا R+ او F+ من خلايا R- اوF- (Tomoeda et al.,1974)، وتعد SDS مادة فعالة تزيل بنسب عالية جداً كل عوامل R وF في جرثومة E. coli أو جزءاً منها عند وجودها بشكل مستقل ولكنها تؤثر في العامل F في حالته المقتحمة (Inuzuka et al.,1969) Hfr، فضلاً عن انها (SDS) مادة فعالة في قدرتها على ازالة البلازميدات المنتجة للبنسيلينيز Penicillinase في جرثومة S. aureus (Tomoeda et al.,1974)، ووجد ايضاً ان سلالتين من S. aureus (PC1 and 196E) عندما تنموان في وسط غذائي يحتوي على 0.002% SDS تتراوح نسبة فقدان القدرة لإنتاج الـ Penicillinaseبين 96.1-100%. والآلية الممكنة في عمل الـSDS هو انها تسبب تحلل في جزء من التركيب السطحي للخلايا ممايؤدي الى تدمير او الحاق الاذى بالبلازميدات التي تقع قريبة من سطح الخلايا الجرثومية.
فضلاً عن ذلك فان Guanidine Hydrochloride (Gu HCl) تعد من المواد المحيدة وتعمل على فقدان مقاومة البنسلين والكادميوم في جرثومة S. aureus عند التركيز النهائي 1.8 مايكروغرام/مل. وقد لوحظ ان معظم المحددات الوراثية لمقاومة المضادات الحيوية في جرثومة S. aureus تقع على العناصر خارج الكروموسومية، فالبلازميدات المحددة لإنتاج الـ Penicillinase تستطيع أيضاً أن تشفر المقاومة للمعادن الثقيلة، ومختلف المواد المحيدة تزيل مقاومة المضادات الحيوية في الجرثومة. وقد تبين أن معدل فقدان المقاومة للبنسلين في سلالة معينة لجرثومة S. aureus بعد معاملتها بالـGuHCl (1.8 مايكروغرام/مل) يتراوح ما بين 8.5 – 77.5% في حين تراوح معدل الازالة التلقائية ما بين 0 – 17.9%، وفي سلالة أخرى فقدت في نفس الوقت مقاومة البنسلين والكادميوم تلقائياً بنسبة تراوحت ما بين 0 – 0.5% وبعد المعاملة مع الـ Gu HCl فالنسبة كانت 1.3 – 11.3% (Costa et al., 1980).
اليوريا Urea من المواد المحيدة، فعند معاملة سلالة E. coli k-12 JE2100 الحاملة لعامل R100 باليوريا انتجت خلايا خالية من البلازميد ولكن بتردد أقل من تأثيرها على عامل F. وتعود آلية التحييد باليوريا إلى حدوث تغيير في فعالية الانزيمات (كتغير في شكل متعدد الببتيد) المسؤول عن تضاعف الـ DNA وبالتالي توقف البلازميدات عن تضاعفها وهذه الآلية ربما تعتمد على كون اليوريا مادة مغيرة لطبيعة البروتين Denaturation. إذ إن زيادة تركيز اليوريا في الوسط أكثر من 300 مايكروغرام/مل يؤدي إلى حدوث زيادة في نسبة تحييد بلازميد F في جرثومة E. coli كما أن لليوريا تأثيراً على بلازميد R ولكن بتردد أقل من تأثيرها على بلازميد F (Tomoeda et al., 1970). وقد لاحظت الباحثة الراشدي ( 2002) أن استخدام اليوريا بتركيز 400 مايكروغرام/مل أدى إلى زيادة كبيرة في نسب تحييد المقاومة لكل من مضادات الـ Ap و Cm و Nal و Cf و Tc و Pen في عدد من عزلات جرثومة Proteus mirabilis والمعزولة من مصادر مختلفة.
أما درجة الحرارة فهي من العوامل الفيزيائية التي لها دور مهم في فقدان البلازميدات، فقد لوحظ أن تنمية جرثومة E. coli عند درجة حرارة 42 – 44 oم أدت إلى تحييد بلازميدات F للجرثومة (Trevors and Trevors, 1986)، وتنمية جرثومة S. epidermidis عند درجة حرارة 44 oم أدت إلى فقدان مورثات -lactamase التي تقع على البلازميد وبتكرار عالٍ (Baldwin et al., 1969) وعند تنمية جرثومة S. aureus بدرجة حرارة 43 oم أدت إلى تحييد البلازميدات المشفرة للـ Penicillinase (Rubin and Rosenblum, 1971). وقد استخدمت جرثومة P. mirabilis مضيفاً لبلازميد Rts1 ولوحظ بأن كمية الـ DNA البلازميدي للـ Rts1 تقل من 7% إلى 3% من كمية الـ DNA الكلي أثناء الساعات القليلة الأولى من النمو عند 42 oم (Dijoseph et al., 1973) وقد لاحظت الباحثة الصفاوي (2001) أن استخدام درجة الحرارة 43 oم بوصفها عاملاً محيداً فيزيائياً لمدة تحضين بلغت 5 و 24 ساعة أظهر إختلافاً محسوساً بين العزلات الجرثومية، وأظهرت جميع عزلات جرثومة S. aureus المدروسة تأثيراً واضحاً عند معاملتها بدرجة حرارة 43 oم مدة 5 ساعات وعند زيادة مدة التحضين إلى 24 ساعة عند درجة 43 oم أظهرت العزلات الجرثومية اختلافاً في إشفاء بلازميداتها لمقاومة المضادات الحيوية وكان أعلى تأثير على المورثات المسؤولة عن إنزيمات الـ b-Lactamase التي تعمل على المضادين الحيويّين أمبسلين وبنسلين في حين احتفظت عزلات أخرى بمقاومتها للمضادات الحيوية.
Plasmids Curing
وتضاعف البلازميد غير معتمد على تضاعف الكروموسوم الاساس Main Chromosome للجراثيم، وفي بعض الحالات تفشل نسخه من البلازميد في الانتقال من الخلية الام إلى إحدى الخليتين البنويتين Daughter Cell.
إن معاملة الخلايا المحتوية على البلازميد بالاكردين Acridine أو بتعريضها لأشعة X أو التجويع للثايميدين Thymidine Starvation سوف تؤدي إلى توقف التضاعف التكراري للبلازميد دون التأثير على تضاعف الكروموسوم الأصلي.
وإحدى السمات المهمة لبلازميدات الجراثيم أنه يمكنها أن تزال من الجينيوم الجرثومي وأكثر المواد الفعاله هي الاكردينات
والتي تتضمن الـ Proflavine وAcriflavine و Acridine Orange و Euflavine (Stanisich and Holloway,1969) وهذه الأكردينات مستخدمة بشكل واسع لازالة مختلف العناصر الوراثية خارج الكروموسوم Extrachromosomal Elements مثل عوامل الخصوبة Sex Factors وعوامل المقاومة R-factors من الخلايا الجرثومية Molnar et al., 1978)، حيث يثبط تضاعف عامل F في الحالة المستقلة في جرثومة E. coli في حين لا تستطيع هذه المواد ازالة عامل F في الحالة المندمجة الكروموسوم في سلالات Hfr) High frequency of recombination) عند المعاملة باصباغ الاكردين فان 100% من خلايا F+ تحيد من الـ F فتصبح F- في حين لا يوجد تحييد للعامل F في سلالات Hfr (Grindley et al., 1970 ;Clowes et al., 1965) إذ أن آلية عمل الاكردينات هو تثبيط تضاعف البلازميد في حين يستمر كروموسوم الخلية الجرثومية بالتضاعف وترتبط الاكردينات ايضاً بالحوامض النووية للجرثومة(Lauer et al ., 1981) وتستطيع إحداث طفرات ازاحة Frameshift Mutations عن طريق دخولها بين زوج من النيوكلوتيدات Nucleotides الذي قد يكون في منشأ التضاعف مما يؤدي الى عرقلة في عزل الـ DNA البلازميدي (Moutschen and Ehrenberg,1985).
ويعمل الاكردين البرتقالي على تحييد F/ lac من جرثومة K-12 E. coli ومن المحتمل انه يقتحم الـDNA ويظهر تأثيراً خاصاً على تضاعف عامل F (Salisbury et al.,1972).
وعند معاملة سلالة Staphylococcus aureus U9W بالبروفلافين او الاكردين البرتقالي فان الخلايا المقاومة تتحول الى خلايا حساسة، على الرغم من ان فقدان المقاومة مع الاكردين البرتقالي بتكرار واطئ الى حد ما فان البروفلافين اقل فعالية في تحويل الخلايا المقاومة الى خلايا حساسة.
فبعد معاملة الخلايا الجرثومية المذكورة سابقاً المقاومة للبنسلين بالاكردين البرتقالي وجد ان اكثر من 6% من الخلايا المقاومة للبنسلين اصبحت حساسة للبنسلين.
وقد بيّنت كل النتائج ان الاكردين البرتقالي اكثر فعالية من البروفلافين في إزالة مقاومة البنسلين والمعدلات العالية لازالة المقاومة وتم الحصول عليها عندما يكون الاس الهيدروجيني للوسط الغذائي 7.6 وهي ظروف ضرورية للازالة المثلى لعاملF.
وقد ذكر Rasool وآخرون أن الاكردين البرتقالي يستخدم بوصفه مادة محيدة لازالة البلازميدات المقاومة للمضادات الحيوية في عزلات Klebsiella spp.، حيث اظهرت العزلات الجرثومية المدروسة اختلافاً في نسب ازالة المقاومة لبعض المضادات الحيوية المدروسة والمحمولة على R- plasmid فضلاً عن فعالية هذا المحيد لازالة عامل الخصوبة F- plasmid والمسؤول عن عملية الاقتران الجرثومي.
كذلك يعمل الاكري فلافين على تثبيط انتقال عامل R بسبب تثبيط خاص لتصنيع الـ DNA الضروري لنقل الـEpisome (Arai and Watanabe, 1967). لاحظ Grindley وآخرون (1970) انه عند معاملة سلالة K12 F+ (K) لجرثومة E. coli K-12 بالاكري فلافين بتركيز 10 مايكروغرام/مل فان 96% من المستعمرات فقدت K، لكن مستعمرتان من المستعمرات العشر المختبرة فقدت عامل الخصوبة F أيضاً وأمكن الحصول على عزلات جرثومية ذات أنماط هي: F+K- و F-K+ و F-K-. فضلاً عن ذلك أن إزالة مقاومة المضادات الحيوية لمجموعة Macrolide (Leucomycin و Oleandomycin و Erythromycin) في سلالات جرثومة S. aureus وذلك عن طريق معاملة السلالات المقاومة بالاكري فلافين (Hashimoto et al., 1964).
بروميد الاثيديوم Ethidium Bromide مادة قوية وأكثر فعالية لتحييد بلازميدات الـ Penicillinase لسلالات S. aureus المقاومة للزئبق وليس من السلالات الحساسة لأيونات الزئبق (Warren et al., 1974 ; Rubin and Rosenblum, 1971) ويرتبط بروميد الاثيديوم مع الـ (DNA) Deoxyribonucleic Acid والـ (RNA) Ribonucleic Acid ويثبط الـ DNA Polymerase والـ RNA Polymerase (Bouanchaud et al., 1969).
ويمكن استخدام المضادات الحيوية بوصفها مواد محيدة ومن امثلتها المضاد الحيوي الريفامبين Rifampin وهو مركب نصف اصطناعي Semisynthetic Compound يثبط نمو الجراثيم الموجبة لصبغة كرام فضلاً عن عدد من الاحياء المجهرية السالبة لصبغة كرام مثل E. coli و Pseudomonas و Klebsiella. ويعد الريفامبين فعالاً جداً ضد ، S. aureus و Haemophilus influenzae و Neisseria meningitidis، وهو قاتل للجراثيم داخل الخلية وخارجها (Behera, 1995 ; Gilman et al., 1985 ) ويثبط الريفامبين نمو الجرثومة عن طريق ارتباطه القوي مع الـ RNA Polymerase فيها لذلك فهو مثبط لتصنيع الـ RNA الجرثومي (Brooks et al., 2001)، حيث يرتبط مع الـ -subunit للـ RNA Polymerase وعلى وجه الخصوص يثبط تصنيع RNA وبذلك يعوق نمو الجرثومة (Gado et al., 1982 ; Linn et al., 1975 ) وللريفامبين تأثير شاف على بعض عناصر DNA الـ Staphylococcal الخارج كروموسومية.
هناك فرضيتان لتفسير آلية عمل الريفامبين:
1- أن الريفامبين يثبط تضاعف DNA الابيسوم مقارنة بـ DNA الكروموسومي.
ويمكن أن يكون التحييد نتيجة لأختزال مستوى تصنيع بعض الجزيئات البروتينية الخاصة والضرورية لتضاعف الابيسوم. أن هذه الفرضية تلقت بعض الدعم من خلال الملاحظات التي تضمنت أن الريفامبين يثبط تعبير بعض جينات F أختيارياً.
2- تتضمن الفرضية الثانية أن جزيئة RNA المعينة ضرورية لتضاعف عامل الجنس Sex Factor واستنساخ هذه الجزيئة يكون حساساً للريفامبين. حيث يمكن أن تصنع إمّا على الكروموسوم أو على الابيسوم.
يمكن تحييد البلازميدات باستخدام Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) فهي مادة قوية للتحييد وتأثيرها في جرثومة E. coli يكون اكثر سمية لخلايا R+ او F+ من خلايا R- اوF- (Tomoeda et al.,1974)، وتعد SDS مادة فعالة تزيل بنسب عالية جداً كل عوامل R وF في جرثومة E. coli أو جزءاً منها عند وجودها بشكل مستقل ولكنها تؤثر في العامل F في حالته المقتحمة (Inuzuka et al.,1969) Hfr، فضلاً عن انها (SDS) مادة فعالة في قدرتها على ازالة البلازميدات المنتجة للبنسيلينيز Penicillinase في جرثومة S. aureus (Tomoeda et al.,1974)، ووجد ايضاً ان سلالتين من S. aureus (PC1 and 196E) عندما تنموان في وسط غذائي يحتوي على 0.002% SDS تتراوح نسبة فقدان القدرة لإنتاج الـ Penicillinaseبين 96.1-100%. والآلية الممكنة في عمل الـSDS هو انها تسبب تحلل في جزء من التركيب السطحي للخلايا ممايؤدي الى تدمير او الحاق الاذى بالبلازميدات التي تقع قريبة من سطح الخلايا الجرثومية.
فضلاً عن ذلك فان Guanidine Hydrochloride (Gu HCl) تعد من المواد المحيدة وتعمل على فقدان مقاومة البنسلين والكادميوم في جرثومة S. aureus عند التركيز النهائي 1.8 مايكروغرام/مل. وقد لوحظ ان معظم المحددات الوراثية لمقاومة المضادات الحيوية في جرثومة S. aureus تقع على العناصر خارج الكروموسومية، فالبلازميدات المحددة لإنتاج الـ Penicillinase تستطيع أيضاً أن تشفر المقاومة للمعادن الثقيلة، ومختلف المواد المحيدة تزيل مقاومة المضادات الحيوية في الجرثومة. وقد تبين أن معدل فقدان المقاومة للبنسلين في سلالة معينة لجرثومة S. aureus بعد معاملتها بالـGuHCl (1.8 مايكروغرام/مل) يتراوح ما بين 8.5 – 77.5% في حين تراوح معدل الازالة التلقائية ما بين 0 – 17.9%، وفي سلالة أخرى فقدت في نفس الوقت مقاومة البنسلين والكادميوم تلقائياً بنسبة تراوحت ما بين 0 – 0.5% وبعد المعاملة مع الـ Gu HCl فالنسبة كانت 1.3 – 11.3% (Costa et al., 1980).
اليوريا Urea من المواد المحيدة، فعند معاملة سلالة E. coli k-12 JE2100 الحاملة لعامل R100 باليوريا انتجت خلايا خالية من البلازميد ولكن بتردد أقل من تأثيرها على عامل F. وتعود آلية التحييد باليوريا إلى حدوث تغيير في فعالية الانزيمات (كتغير في شكل متعدد الببتيد) المسؤول عن تضاعف الـ DNA وبالتالي توقف البلازميدات عن تضاعفها وهذه الآلية ربما تعتمد على كون اليوريا مادة مغيرة لطبيعة البروتين Denaturation. إذ إن زيادة تركيز اليوريا في الوسط أكثر من 300 مايكروغرام/مل يؤدي إلى حدوث زيادة في نسبة تحييد بلازميد F في جرثومة E. coli كما أن لليوريا تأثيراً على بلازميد R ولكن بتردد أقل من تأثيرها على بلازميد F (Tomoeda et al., 1970). وقد لاحظت الباحثة الراشدي ( 2002) أن استخدام اليوريا بتركيز 400 مايكروغرام/مل أدى إلى زيادة كبيرة في نسب تحييد المقاومة لكل من مضادات الـ Ap و Cm و Nal و Cf و Tc و Pen في عدد من عزلات جرثومة Proteus mirabilis والمعزولة من مصادر مختلفة.
أما درجة الحرارة فهي من العوامل الفيزيائية التي لها دور مهم في فقدان البلازميدات، فقد لوحظ أن تنمية جرثومة E. coli عند درجة حرارة 42 – 44 oم أدت إلى تحييد بلازميدات F للجرثومة (Trevors and Trevors, 1986)، وتنمية جرثومة S. epidermidis عند درجة حرارة 44 oم أدت إلى فقدان مورثات -lactamase التي تقع على البلازميد وبتكرار عالٍ (Baldwin et al., 1969) وعند تنمية جرثومة S. aureus بدرجة حرارة 43 oم أدت إلى تحييد البلازميدات المشفرة للـ Penicillinase (Rubin and Rosenblum, 1971). وقد استخدمت جرثومة P. mirabilis مضيفاً لبلازميد Rts1 ولوحظ بأن كمية الـ DNA البلازميدي للـ Rts1 تقل من 7% إلى 3% من كمية الـ DNA الكلي أثناء الساعات القليلة الأولى من النمو عند 42 oم (Dijoseph et al., 1973) وقد لاحظت الباحثة الصفاوي (2001) أن استخدام درجة الحرارة 43 oم بوصفها عاملاً محيداً فيزيائياً لمدة تحضين بلغت 5 و 24 ساعة أظهر إختلافاً محسوساً بين العزلات الجرثومية، وأظهرت جميع عزلات جرثومة S. aureus المدروسة تأثيراً واضحاً عند معاملتها بدرجة حرارة 43 oم مدة 5 ساعات وعند زيادة مدة التحضين إلى 24 ساعة عند درجة 43 oم أظهرت العزلات الجرثومية اختلافاً في إشفاء بلازميداتها لمقاومة المضادات الحيوية وكان أعلى تأثير على المورثات المسؤولة عن إنزيمات الـ b-Lactamase التي تعمل على المضادين الحيويّين أمبسلين وبنسلين في حين احتفظت عزلات أخرى بمقاومتها للمضادات الحيوية.
